PCR Testleriyle KoronaVirüs Tespitinin Geçerliliğine İlişkin Makaleye Dair Hatalar ve İlgili Makaleyi Geri Çekme Talebine Dair 20 Uzman Bilim İnsanı İmzalı Çalışma
(Ekleyenini Notu: Aşağıdaki belge; Corman ve Drosten Raporu ya da Kağıdı olarak belirtilen "Gerçek zamanlı RT-PCR ile 2019 yeni koronavirüsün (2019-nCoV) tespiti" adlı Eurosurveillance (Avrupa bulaşıcı hastalık sürveyansı, epidemiyoloji, önleme ve kontrol dergisi) ve Pubmed makalelerinin hatalarını içerdiğini iddia etmekte bu nedenle ilgili makalenin geri çekilmesi talebini barındırmaktadır.
Geri Çekilmesi İstenen Makaleler
İlgili Eurosurveillance Makalesi ; PUBMED Makalesi
CORMAN-DROSTEN İNCELEME RAPORU : HATALI POZİTİF PCR TEST SONUÇLARININ SONUÇLARI
ULUSLARARASI BİR ULUSLARARASI YAŞAM BİLİMLERİ KONSORSİYUMU (ICSLS)
İnceleme raporu Corman-Drosten ve ark. Eurosurveillance 2020
27 Kasım 2020
Bu kapsamlı inceleme raporu, 27 Kasım 2020 tarihinde, sunum portalları aracılığıyla Eurosurveillance yayın kuruluna resmi olarak sunulmuştur, bu inceleme raporunun ekinde , tüm ana ve ortak yazarlar tarafından imzalanmış bir geri çekme talebi mektubu bulunmaktadır . Birinci ve son olarak listelenen isimler, birinci ve ikinci ana yazarlardır. Aradaki tüm isimler ortak yazardır.
SARS-CoV-2'yi tespit etmek için RTPCR testinin harici meslektaş incelemesi, moleküler ve metodolojik düzeyde 10 büyük bilimsel kusuru ortaya koymaktadır: yanlış pozitif sonuçların sonuçları.
ÖZ
"Gerçek zamanlı RT-PCR ile 2019 yeni koronavirüsün (2019-nCoV) tespiti" (Eurosurveillance 25 (8) 2020) başlıklı yayında yazarlar, 2019-nCoV tespiti ve teşhisi için tanısal bir iş akışı ve RT-qPCR protokolü sunar. (şimdi SARS-CoV-2 olarak biliniyor), doğrulanmış olduklarını iddia ettikleri ve halk sağlığı laboratuvarı ortamlarında kullanım için sağlam bir teşhis metodolojisi.
Bu yayından dünya çapındaki toplumlar için ortaya çıkan tüm sonuçların ışığında, bir grup bağımsız araştırmacı, 1) sunulan test tasarımının tüm bileşenlerinin çapraz kontrol edildiği, 2) RT-qPCR protokolü önerileri, iyi laboratuvar uygulamaları için değerlendirildi ve 3) parametreler alanı kapsayan ilgili bilimsel literatüre göre incelendi.
2019-nCoV tespiti ve teşhisi için yayınlanan RT-qPCR protokolü ve el yazması, yetersiz primer tasarımı, sorunlu ve yetersiz bir RT-qPCR protokolü ve doğru bir test doğrulamasının bulunmaması gibi çok sayıda teknik ve bilimsel hatadan muzdariptir. Ne sunulan test ne de el yazması, kabul edilebilir bir bilimsel yayın için gereksinimleri karşılamıyor. Ayrıca yazarların ciddi çıkar çatışmalarından bahsedilmemiştir. Son olarak, yayının sunulması ve kabulü arasındaki çok kısa zaman çizelgesi (24 saat), ya burada sistematik bir emsal değerlendirme sürecinin gerçekleştirilmediğini ya da sorunlu düşük kalitede olduğunu gösterir. Çeşitli bilimsel yetersizlikler, hatalar ve kusurlar için ikna edici kanıtlar sağlıyoruz.
Burada sunulan bilimsel ve metodolojik kusurları göz önüne aldığımızda, Eurosurveillance'ın yayın kurulunun yayını geri çekmekten başka seçeneği olmadığına eminiz.
KESKİN İNCELEME RAPORU
Bu makale, önemi SARS-CoV-2'ye atfedilen ve COVID-19 hastalığı ile ilişkili enfeksiyonların dünya çapında yanlış teşhisine yol açan Corman-Drosten makalesinde çok sayıda ciddi kusur gösterecektir. Pek çok insanın hayatını ve geçim kaynaklarını yok eden sıkı kilitlenmelerle karşı karşıyayız, eğitime sınırlı erişim ve dünya çapında hükümetler tarafından uygulanan bu kısıtlamalar, insanların temel haklarına ve kişisel özgürlüklerine doğrudan bir saldırıdır ve bu da tüm ekonomiler için ikincil zararla sonuçlanır. küresel ölçek.
Aşağıdaki bölümlerde daha ayrıntılı olarak ana hatlarıyla açıklayacağımız Corman-Drosten makalesinde on ölümcül sorun var.
İlk ve en önemli sorun, yeni Coronavirus SARS-CoV-2'nin (2019-nCoV adlı yayında ve Şubat 2020'de uluslararası bir virüs uzmanları konsorsiyumu tarafından SARS-CoV-2 adlı yayında) in silico (teorik) dizilerine dayanıyor olmasıdır. , Çin'deki bir laboratuar tarafından tedarik edildi [1], çünkü o zamanlar ne bulaşıcı ("canlı") veya inaktive SARS-CoV-2 kontrol materyali ne de virüsün izole edilmiş genomik RNA'sı yazarlar tarafından mevcut değildi. Bugüne kadar yazar tarafından izole edilmiş SARS-CoV-2 virüslerine veya bunların tam uzunlukta RNA'sına dayalı hiçbir doğrulama yapılmamıştır. Corman ve diğerlerine göre:
"Virüs materyali bulunmadan halk sağlığı laboratuvarı ortamlarında kullanılmak üzere sağlam teşhis metodolojisi geliştirmeyi ve uygulamayı hedefledik." [1]
Buradaki odak, belirtilen iki amaca odaklanmalıdır: a) geliştirilmesi ve b) halk sağlığı laboratuvarı ortamlarında kullanılmak üzere bir teşhis testinin uygulanması . Mevcut herhangi bir gerçek virüs materyali olmadan bu hedeflere ulaşılamaz (örneğin, bulaşıcı viral yükü belirlemek için). Her durumda, bu büyüklükteki herhangi bir senaryo-sonucu için yalnızca maksimum doğruluğa sahip bir protokol zorunlu ve birincil hedef olabilir. Kritik viral yük tespiti zorunlu bilgidir ve bu deneyleri gerçekleştirmek ve önemli verileri sağlamak Christian Drosten'in grup sorumluluğundadır.
Bununla birlikte, bunlar in siliko diziler, yukarıda bahsedilen virüsü tanımlamak için bir RT-PCR test metodolojisi geliştirmek için kullanıldı. Bu model, her ikisi de beta koronavirüs olduğu için yeni virüsün 2003 SARS-CoV'ye çok benzer olduğu varsayımına dayanıyordu.
PCR testi bu nedenle Sarbeco bileşeni için bir kontrol materyali olarak SARS-CoV'nin genomik sekansı kullanılarak tasarlanmıştır; Bunu, Corman-Drosten makalesinin ortak yazarlarından biri [2] ile yaptığımız kişisel e-posta iletişimimizden biliyoruz. SARS-CoV-2'yi modellemeye yönelik bu yöntem, Corman-Drosten makalesinde şu şekilde açıklanmıştır:
" 2019-nCoV taraması ve özel onay için teşhis iş akışının oluşturulması ve doğrulanması , mevcut virüs izolatlarının veya orijinal hasta örneklerinin yokluğunda tasarlanmış. Tasarım ve doğrulama, 2003 SARS-CoV ile yakın genetik ilişki sayesinde sağlandı ve sentetik nükleik asit teknolojisinin kullanımıyla desteklendi. "
Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR), önceden bilinen nadir RNA fragmanlarını hızla tespit etmek için önemli bir biyomoleküler teknolojidir. İlk adımda, numunede bulunan RNA molekülleri cDNA'yı vermek için ters transkripsiyona tabi tutulur. Daha sonra cDNA, spesifik bir primer çifti ve termostabil bir DNA polimeraz enzimi kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonunda amplifiye edilir. Teknoloji oldukça hassastır ve tespit limiti teorik olarak 1 cDNA molekülüdür. PCR'nin özgüllüğü, biyomoleküler tasarım hatalarından oldukça etkilenir.
Corman-Drosten yayınında açıklanan bir RT-PCR Testi ve kantitatif RT-qPCR testi tasarlarken önemli olan nedir?
1. Primerler ve problar:
a) primerlerin ve probların konsantrasyonu optimum aralıkta olmalıdır
(100-200 nM)
b) amplifiye etmek istediğiniz hedef gene özel
olmalıdır c) toplam nitrojenli bazlara göre optimum GC içeriği yüzdesine sahip olmalıdır ( minimum% 40, maksimum% 60)
d) virüs teşhisi için en az 3 primer çifti 3 viral geni tespit etmelidir (tercihen viral genomda mümkün olduğu kadar uzak)
2. Tüm reaksiyonların gerçekleştiği sıcaklık:
a) DNA erime sıcaklığı (> 92 °)
b) DNA amplifikasyon sıcaklığı (TaqPol'e özgü)
c) Tm; tavlama sıcaklığı (primerlerin ve probların hedef bağlanmaya / ayrılmaya ulaştığı sıcaklık, primer çifti başına 2 ° C'yi geçmemelidir). Tm, büyük ölçüde primerlerin GC içeriğine bağlıdır
3. Amplifikasyon döngülerinin sayısı (35'ten az; tercihen 25-30 döngü);
Virüs tespiti durumunda,> 35 döngü yalnızca hücre kültüründe izolasyonla belirlendiği üzere bulaşıcı virüs ile ilişkili olmayan sinyalleri tespit eder [2'de gözden geçirilmiştir]; 35 döngü veya daha yüksek bir eşik kullanıldığında (Avrupa ve ABD'deki çoğu laboratuvarda olduğu gibi) bir kişi PCR ile pozitif olarak test edilirse, söz konusu kişinin gerçekten enfekte olma olasılığı% 3'ten azdır. söz konusu sonuç yanlış pozitif% 97'dir [3'te gözden geçirilmiştir]
4. Moleküler biyolojik doğrulamalar; amplifiye PCR ürünleri, ürünleri bir DNA cetveli ile bir jel içinde çalıştırarak veya doğrudan DNA dizileme yoluyla doğrulanmalıdır.
5. Spesifik virüs tespitini onaylamak / çürütmek için pozitif ve negatif kontroller belirtilmelidir.
6. Mevcut bir Standart Operasyonel Prosedür (SOP) olmalıdır
SOP, yukarıdaki parametreleri kesin olarak belirtir, böylece tüm laboratuvarlar aynı test koşullarını ayarlayabilir. Doğrulanmış bir evrensel SÇP'ye sahip olmak esastır, çünkü ülkeler içinde ve arasında verilerin karşılaştırılmasını sağlar.
CORMAN-DROSTEN KAĞIT İLE İLGİLİ KÜÇÜK ENDİŞELER
1. Corman-Drosten kağıdının Tablo 1'inde farklı kısaltmalar belirtilmiştir - "nM" belirtilmiştir, "nm" belirtilmemiştir. Doğru isimlendirmeye gelince, nm “nanometre” anlamına gelir, bu nedenle nm burada nM'yi okumalıdır.
2. Genetik dizileri her zaman 5'-3 'yönünde, ters primerler de dahil olmak üzere yazmak genel fikir birliğidir. Yazarların Corman-Drosten makalesinde şekil 2'de yaptığı gibi, astar dizisinin ters tamamlayıcı yazımı ile hizalama yapmak oldukça sıra dışıdır. Burada ek olarak, bir yalpalama tabanı, Y'nin temsil ettiği bazların açıklaması olmadan "y" olarak işaretlenir.
3. Corman-Drosten kağıdındaki iki yanıltıcı tuzak, Tablo 1'in Tm-değerlerini (tavlama-sıcaklık değerleri) içermemesi ve GC-değerlerini (dizilerdeki G ve C sayılarının%-değeri olarak göstermemesidir) toplam bazlar).
CORMAN-DROSTEN KAĞITLA İLGİLİ BÜYÜK ENDİŞELER
ARKA PLAN
Yazarlar, bilimsel çalışmalarının arka planını şu şekilde açıklıyor: "Yakın zamanda ortaya çıkan yeni koronavirüsün (2019-nCoV) devam eden salgını, salgının daha yaygın olduğuna dair artan kanıtlar varken virüs izolatlarının mevcut olmaması nedeniyle halk sağlığı laboratuvarları için bir zorluk teşkil ediyor. başlangıçta düşünülmüş ve gezginler aracılığıyla uluslararası yayılma zaten gerçekleşmiştir ”.
BBC News [4] ve Google Statistics [5] 'e göre, yazının gönderildiği 21 Ocak 2020'de dünya çapında 6 ölüm meydana geldi. O zamanlar salgının başlangıçta düşünüldüğünden daha yaygın olduğunu gösteren önemli bir kanıt yokken yazarlar neden halk sağlığı laboratuvarları için bir meydan okuma üstlendi?
Bir amaç olarak yazarlar, virüs materyali bulunmadan halk sağlığı laboratuvarı ortamlarında kullanılmak üzere sağlam teşhis metodolojisi geliştirip uyguladıklarını beyan ettiler. Dahası, "Bu çalışma, ulusal ve Avrupa araştırma ağlarında akademik ve kamu laboratuvarlarının koordinasyonu yoluyla elde edilen muazzam yanıt kapasitesini göstermektedir."
B) YÖNTEMLER VE SONUÇLAR
1. Primer ve Prob Tasarımı
1a) Hatalı primer konsantrasyonları
Güvenilir ve doğru PCR testi protokolleri normalde primer başına 100 nM ile 200 nM arasında kullanılarak tasarlanır [7]. Corman-Drosten makalesinde, birkaç primer için alışılmadık derecede yüksek ve değişen primer konsantrasyonları gözlemliyoruz (tablo 1). RdRp_SARSr-F ve RdRp_SARSr-R primer çiftleri için sırasıyla 600 nM ve 800 nM açıklanmaktadır. Benzer şekilde, N_Sarbeco_F ve N_Sarbeco_R primer seti için sırasıyla 600 nM ve 800 nM tavsiye ederler [1].
Bu konsantrasyonların, hedef genlerin spesifik amplifikasyonları için optimal olamayacak kadar çok yüksek olduğu açık olmalıdır. Bu protokolde bu son derece yüksek primer konsantrasyonlarını kullanmak için belirli bir neden yoktur. Daha ziyade, bu konsantrasyonlar artan spesifik olmayan bağlanmaya ve PCR ürünü amplifikasyonuna yol açar.
Tablo 1: Primerler ve problar (Corman-Drosten kağıdından uyarlanmıştır; hatalı primer konsantrasyonları vurgulanmıştır)
1b) Belirtilmemiş ("Titrek") primer ve prob dizileri
Tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için, primer çiftlerini ayırt edici şekilde tanımlamak önemlidir. Corman-Drosten makalesinde R, W, M ve S harfleriyle gösterilen altı belirtilmemiş pozisyon gözlemledik (Tablo 2). W harfi, bu konumda bir A veya bir T olabileceği anlamına gelir; R, bir G veya bir A olabileceğini belirtir; M, pozisyonun A veya C olabileceğini belirtir; S harfi, bu konumda bir G veya C olabileceğini gösterir.
Bu yüksek sayıdaki varyantlar sadece olağandışı değil, aynı zamanda laboratuvarlar için oldukça kafa karıştırıcıdır. Bu altı belirtilmemiş pozisyon, SARS-CoV-2 (2 farklı RdRp_SARSr_F primeri + 8 farklı RdRp_SARS_P1 sondası + 4 farklı RdRp_SARSr_R) ile ilgili olmayan birkaç farklı alternatif primer dizisinin tasarımıyla kolayca sonuçlanabilir.Tasarım varyasyonları kaçınılmaz olarak SARS CoV-2 ile ilgili bile olmayan sonuçlara yol açacaktır. Bu nedenle, Corman-Drosten kağıdındaki kafa karıştırıcı spesifik olmayan açıklama, Standart Çalışma Protokolü olarak uygun değildir. Bu belirtilmemiş pozisyonlar kesin olarak tasarlanmalıydı.
Bu titrek sekanslar zaten bu alanda bir endişe kaynağı oluşturdu ve Pillonel ve diğerleri tarafından yazılan Editöre Mektup ile sonuçlandı. [8] açıklanan dizilerdeki bariz hatalarla ilgili. Bu hatalar, Corman ve ark. ek olarak da.
Tablo 2: Primerler ve problar (Corman-Drosten kağıdından uyarlanmıştır; primerlerdeki belirtilmemiş ("Wobbly") nükleotidler vurgulanmıştır)
Doğrudan Corman-Drosten makalesinden türetilen WHO protokolü (Şekil 1), SARS-CoV-2'nin varlığını doğrulamak için iki kontrol geninin (E-ve RdRp-genleri) tanımlanması gerektiği sonucuna varır. tahlilde. RdPd geninin ileri-primerde (R = G / A) bir belirsiz pozisyona ("yalpalı"), ters primerde iki belirsiz pozisyona (R = G / A; S = G) sahip olduğuna dikkat edilmelidir. / C) ve RdRp-probunda üç belirsiz konumu vardır (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Bu nedenle, iki farklı ileri primer, dört farklı ters primer ve sekiz farklı prob, RdPd-geni için sentezlenebilir. Birlikte 64 olası primer ve prob kombinasyonu vardır!
Corman-Drosten makalesi ayrıca, WHO protokolüne göre daha fazla doğrulanmayan ve gereksiz görülen üçüncü bir geni tanımlar:
"Dikkat çekici bir nokta, N gen tahlili de iyi performans gösterdi, ancak biraz daha az duyarlı olduğu için yoğun ileri doğrulamaya tabi tutulmadı."
Doğrulayıcı deneyler olarak üç gen PCR'sinin tümünü kullanmak en iyisi olacağı için bu talihsiz bir ihmaldi ve bu neredeyse yeterli bir virüs RNA tespit aracı protokolü ile sonuçlanacaktı. Üç doğrulayıcı tahlil adımı, "Titrek" noktalara ilişkin olarak her katlama adımında en azından hataları ve belirsizlikleri en aza indirecektir. (Yine de, diğer tüm tasarım hatalarını hesaba katarken, protokol yine de herhangi bir “iyi laboratuvar uygulaması” ndan eksik kalacaktır).
Mevcut haliyle, N gen testi ne yazık ki ne DSÖ tavsiyesinde (Şekil 1) zorunlu ve çok önemli bir üçüncü doğrulama adımı olarak önerilmemiştir, ne de Corman-Drosten makalesinde "rutin bir iş akışı için" önemli isteğe bağlı güvence olarak vurgulanmamıştır (Tablo 2).
Sonuç olarak, dünya çapındaki neredeyse tüm test prosedürlerinde, üçü de yerine sadece 2 primer eşleşmesi kullanılmıştır. Bu gözetim, devam eden bir pandemide gerçek önemi olan doğru test sonuçlarının sağlanması açısından tüm test protokolünü işe yaramaz hale getirir.
Şekil 1: N-Gene doğrulama testi ne aşağıdaki resmi WHO Drosten-Corman protokol önerisinde gerekli üçüncü adım olarak vurgulanmıştır [8] ne de Eurosurveillance yayınında daha yüksek test doğruluğu için çok önemli bir adım olarak gerekli değildir.
1c) Hatalı GC içeriği (tavlama sıcaklığı (Tm) ile birlikte 2c'de tartışılmıştır)
1d) Viral genlerin tespiti
RT-PCR, enfeksiyonun birincil teşhisi için tavsiye edilmez. Bu nedenle, COVID-19'un saptanması için klinik rutinde kullanılan RT-PCR Testi, düzenleyici bir temelde COVID-19 teşhisi için endike değildir.
“Klinisyenlerin enfeksiyonların teşhisi için moleküler tanı tekniklerinin gelişmiş doğruluğunu ve hızını kabul etmeleri ve aynı zamanda sınırlamalarını anlamaları gerekir. Laboratuvar sonuçları her zaman hastanın klinik sunumu bağlamında yorumlanmalıdır ve güvenilir test sonuçları için uygun yer, kalite ve numune toplama zamanlaması gereklidir ”. [9]
Bununla birlikte, doktorun farklı akciğer enfeksiyonlarını ayırt etmesi gerektiğinde ayırıcı tanısına yardımcı olmak için kullanılabilir (Grip, Covid-19 ve SARS'ın çok benzer semptomları vardır). Spesifik bir virüsün doğrulayıcı teşhisi için, 3 virüse spesifik geni tespit etmek için en az 3 spesifik primer çifti uygulanmalıdır. Tercihen, bu hedef genler, viral genomda (zıt uçlar dahil) mümkün olan en büyük mesafeye yerleştirilmelidir.
Corman-Drosten makalesi 3 primeri tanımlasa da, bu primerler virüsün genomunun sadece kabaca yarısını kapsıyor. Bu, bozulmamış COVID-19 virüs RNA'sının saptanması için özgüllüğü azaltan ve yanlış pozitif test sonuçlarının alıntısını artıran başka bir faktördür.
Bu nedenle, bir numunede üç pozitif sinyal elde etsek bile (yani üç primer çifti 3 farklı amplifikasyon ürünü verir), bu bir virüsün varlığını kanıtlamaz. Daha iyi bir primer tasarımı, viral genomun her iki ucunda da terminal primerlere sahip olacaktır. Bunun nedeni, tüm viral genomun kapsanması ve üç pozitif sinyalin, tam (ve dolayısıyla potansiyel olarak enfeksiyöz) bir virüs ile parçalanmış viral genomlar (enfeksiyöz potens olmaksızın) arasında daha iyi ayrım yapabilmesidir.Virüsün bulaşıcılığı hakkında önemli herhangi bir şey çıkarabilmek için, SARS-CoV virüslerinin temel replikaz enzimini kodlayan Orf1 geninin hedef olarak dahil edilmesi gerekir (Şekil 2). En ağır ve değişken şekilde kopyalanan viral genom bölgesindeki hedeflerin konumlandırılması, protokolün bir başka zayıflığıdır.
Kim vd. Sars-CoV-2'de oldukça değişken bir 3 'subgenomik RNA ekspresyonu gösterdi [23]. Bu RNA'lar, asemptomatik ve enfeksiyöz olmayan hastalar için imza olarak aktif olarak izlenir [10]. Bir primerin 3 ana ucunda 6 baz çifti primer-dimer bulunan qPCR primerleri olan asemptomatik insan popülasyonunu taramak oldukça şüphelidir (Şekil 3).
Görünüşe göre WHO bu primerleri tavsiye ediyor. Corman-Drosten kağıdından tüm yalpalama türevlerini Thermofisher'in primer dimer web aracı [11] ile test ettik. RdRp ileri primeri, Sarbeco E Reverse ile 6bp 3prime homolojisine sahiptir. Yüksek primer konsantrasyonlarında bu, yanlışlıklar yaratmak için yeterlidir.
Not: Bağışıklık sistemi zayıflamış hastalarda bulunan bir klinik patojenle (Pantoea) N primerlerinden birinin mükemmel bir uyumu vardır. Ters primer Pantoea'ya da vurur, ancak aynı bölgede değildir (Şekil 3).
Bunlar ciddi tasarım hatalarıdır çünkü test tüm virüs ve viral fragmanlar arasında ayrım yapamaz. Test, SARS virüsleri için bir teşhis olarak kullanılamaz.
Şekil 2: SARS koronavirüs ve 2019 yeni koronavirüs genomu üzerindeki amplikon hedeflerinin göreceli konumları. ORF: açık okuma çerçevesi; RdRp: RNA'ya bağımlı RNA polimeraz. Amplikonun altındaki sayılar SARS-CoV, NC_004718 [1] 'e göre genom pozisyonlarıdır;
Şekil 3: Thermofischer'in primer dimer web aracıyla yapılan bir test, RdRp ileri primerinin Sarbeco E Reverse (sol kutu) ile 6bp 3` prime homolojisine sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Başka bir test, bağışıklığı zayıflamış hastalarda (sağ kutu) bulunan bir klinik patojenle (Pantoea) N-primerlerinden biri için mükemmel bir eşleşme olduğunu ortaya koymaktadır.
2. Reaksiyon sıcaklıkları
2a) DNA erime sıcaklığı (> 92 °).
Corman-Drosten makalesinde yeterince ele alınmıştır.
2b) DNA amplifikasyon sıcaklığı.
Corman-Drosten makalesinde yeterince ele alınmıştır.
2c) Hatalı GC içerikleri ve Tm
Tavlama sıcaklığı, primerin hangi sıcaklıkta hedef diziden bağlandığını / ayrıldığını belirler. Etkili ve spesifik bir amplifikasyon için, primerlerin GC içeriği minimum% 40 ve maksimum% 60 amplifikasyonu karşılamalıdır. Tablo 3'te belirtildiği gibi, Corman-Drosten kağıdında açıklanan primerlerin üçü, GC içeriği için normal aralıkta değildir. İki primer (RdRp_SARSr_F ve RdRp_SARSr_R), yalpalama bazlarının tüm olası varyantları için% 28 -% 31 arasında alışılmadık ve çok düşük GC değerlerine sahipken, primer E_Sarbeco_F% 34,6'lık bir GC değerine sahiptir (Tablo 3 ve Tablo 3'ün ikinci paneli) .
GC içeriğinin, baz eşleşmesindeki üç hidrojen bağı nedeniyle kendi spesifik hedefine bağlanmayı büyük ölçüde belirlediğine dikkat edilmelidir. Dolayısıyla, primerin GC içeriği ne kadar düşükse, spesifik hedef gen sekansına (yani, saptanacak gen) bağlanma kapasitesi o kadar düşük olur. Bu, bir hedef sekansın tanınması için, primerin tekrar ayrılmaması için gerçek tavlama sıcaklığına (en iyi uygulama değeri) mümkün olduğunca yakın bir sıcaklık seçmemiz gerektiği ve aynı zamanda özellikle hedef sıra.
RdRp ters primerlerin tüm titreyen varyantları için gözlemlendiği gibi Tm-değeri çok düşükse, primerler spesifik olmayan birkaç hedefe bağlanabilir, spesifiteyi azaltır ve potansiyel yanlış pozitif sonuçları artırır.
Tavlama sıcaklığı (Tm), qPCR prosedürünün özgüllüğünün / doğruluğunun belirlenmesi için çok önemli bir faktördür ve qPCR protokollerinin doğruluğunu değerlendirmek için gereklidir. En iyi uygulama önerisi: Her iki primer (ileri ve geri) neredeyse benzer bir değere, tercihen aynı değere sahip olmalıdır.
Corman-Drosten kağıdında kullanılan tüm primerler için en iyi uygulama değerlerini değerlendirmek için ücretsiz olarak temin edilebilen primer tasarım yazılımı Primer-BLAST [12, 25] kullandık (Tablo 3). Tüm primerler için benzer şekilde mümkün olan en yüksek% GC değerini ararken 60 ° C'lik bir Tm değeri bulmaya çalıştık. Primer çiftleri içinde 2 ° C'lik maksimum Tm farkı kabul edilebilir olarak kabul edildi. Corman-Drosten kağıdında belirtilen primer çiftlerini test ederek, primer çifti1 (RdRp_SARSr_F ve RdRp_SARSr_R) için tavlama sıcaklığı Tm'ye göre 10 ° C'lik bir fark gözlemledik. Bu çok ciddi bir hatadır ve protokolü belirli bir teşhis aracı olarak işe yaramaz hale getirir.
Ek testler, yalnızca N-genini (N_Sarbeco_F ve N_Sarbeco_R) amplifiye etmek için tasarlanan primer çiftinin, yeterli bir GC içeriğine ve primerler (N_Sarbeco_F ve N_Sarbeco_R) arasındaki Tm farkına sahip olduğundan tanısal bir testte çalışmak için yeterli standarda ulaştığını göstermiştir. ) 1,85 ° C'dir (2 ° C'lik önemli maksimum farkın altında). Önemlisi, bu ne virüs örneklerinde test edilen (Tablo 2) ne de doğrulayıcı bir test olarak vurgulanmayan gendir. Bu primerlerdeki oldukça değişken erime sıcaklıklarına ve dejenere dizilere ek olarak, prosedürün özgüllüğünü etkileyen başka bir faktör daha vardır: dNTP'ler (0.4uM), oldukça spesifik bir amplifikasyon için önerilenden 2 kat daha yüksektir. Reaksiyona eklenen ilave magnezyum sülfat da vardır. Düşük bir tavlama sıcaklığı ile birleştirilen bu prosedür, spesifik olmayan amplifikasyonlar oluşturabilir. QPCR için ek magnezyum gerektiğinde, testin özgüllüğü daha fazla incelenmelidir.
Burada açıklanan tasarım hataları o kadar ciddidir ki, SARS-CoV-2 genetik materyalinin spesifik amplifikasyonunun Corman-Drosten kağıdının protokolü kullanılarak meydana gelmesi pek olası değildir.
Tablo 3: Primerler ve probların GC içeriği (Corman-Drosten kağıdından uyarlanmıştır; optimize edilmiş GC içeriklerinden kaynaklanan sapmalar vurgulanmıştır.İkinci Panel, kullanılan tüm primerler ve problar için tüm Primer-BLAST en iyi uygulama değerlerinin bir tablo listesini gösterir. Prof.Dr.Ulrike Kämmerer ve ekibi tarafından hazırlanan Corman-Drosten makalesi
3. Amplifikasyon döngülerinin sayısı
Corman-Drosten makalesinde herhangi bir yerde bir testin pozitif veya negatif olduğuna veya gerçekten de pozitif veya negatif sonucu neyin tanımladığından bahsedilmediğine dikkat edilmelidir. Bu tür virolojik tanısal testler, doğrulanmış ve sabit sayıda PCR döngüsü (Ct değeri) dahil olmak üzere, bir numunenin pozitif veya negatif olarak kabul edildiği bir SÇP'ye dayanmalıdır. Makul derecede güvenilir maksimum Ct değeri 30 döngüdür. 35 döngü Ct'nin üzerinde, hızla artan sayıda yanlış pozitif beklenmelidir.
35 döngü Ct değerinden sonra pozitif olarak değerlendirilen PCR verileri tamamen güvenilmezdir.
Jaafar ve ark. 2020 [3]: "Ct = 35'te, PCR için pozitif bir sonuç bildirmek için kullandığımız değer, kültürlerin <% 3'ü pozitif." Başka bir deyişle, bu yüksek Ct değerlerinde SARS-CoV-2'nin başarılı bir virüs izolasyonu yoktu.
Ayrıca, bilimsel çalışmalar, yalnızca bulaşıcı olmayan (ölü) virüslerin 35 Ct değerleri ile tespit edildiğini göstermektedir [22].
30 ile 35 arasında, pozitif bir testin kesin olarak kurulamayacağı gri bir alan vardır. Bu alan dışlanmalıdır. Elbette, Corman-Drosten WHO protokolünde önerildiği gibi 45 PCR döngüsü gerçekleştirilebilir (Şekil 4), ancak daha sonra makul bir Ct-değeri de tanımlamanız gerekir (30'u geçmemelidir). Ancak Ct değeri 45 olan bir analitik sonuç, bilimsel ve tanısal olarak kesinlikle anlamsızdır (makul bir Ct değeri 30'u geçmemelidir). Bütün bunlar çok açık bir şekilde iletilmelidir. Corman-Drosten makalesinin, bir numunenin açık bir şekilde pozitif veya negatif bir test sonucu olarak değerlendirilebileceği maksimum Ct değerinden bahsetmemesi önemli bir hatadır. Bu önemli döngü eşiği sınırı, bugüne kadar herhangi bir takip sunumunda da belirtilmemiştir.
Şekil 4: Resmi Corman-Drosten WHO protokolündeki [8] RT-PCR Kit tavsiyesi. Karşılık gelen ve bilimsel olarak makul Ct (Kesim-değeri) olmadan yalnızca bir "Döngüleyici" değeri (döngüler) bulunmalıdır. Bu veya başka herhangi bir döngü değeri, gerçek Corman-Drosten makalesinde hiçbir yerde bulunamaz.
4. Biyomoleküler doğrulamalar
Amplifiye edilmiş ürünlerin gerçekten SARS-CoV-2 genleri olup olmadığını belirlemek için, amplifiye PCR ürünlerinin biyomoleküler doğrulaması gereklidir. Teşhis testi için bu doğrulama mutlak bir zorunluluktur.
PCR ürünlerinin doğrulanması, ürünün boyutunun tahmin edilebilmesi için PCR ürününü% 1 agaroz-EtBr jel içinde bir boyut göstergesi (DNA cetveli veya DNA merdiveni) ile birlikte çalıştırarak gerçekleştirilmelidir. Boyut, amplifikasyon ürününün hesaplanan boyutuna karşılık gelmelidir. Ancak amplifikasyon ürününü sıralamak daha da iyidir. İkincisi, amplifikasyon ürününün kimliği hakkında% 100 kesinlik verecektir. Moleküler doğrulama olmadan, amplifiye edilmiş PCR ürünlerinin kimliği hakkında emin olunamaz. Daha önce açıklanan ciddi tasarım hataları göz önüne alındığında, güçlendirilmiş PCR ürünleri herhangi bir şey olabilir.
Corman-Drosten makalesinde ayrıca küçük qPCR parçaları (yaklaşık 100bp) söz konusu değildir:% 1,5 agaroz jel veya hatta bir akrilamid jel olabilir.
Bu PCR ürünlerinin moleküler düzeyde doğrulanmamış olması, protokolün bir başka çarpıcı hatasıdır ve buna dayanan herhangi bir testi, SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için özel bir teşhis aracı olarak işe yaramaz hale getirir.
5. Belirli virüs tespitini onaylamak / çürütmek için pozitif ve negatif kontroller.
Corman-Drosten makalesinde açıklanan doğrulanmamış varsayım, SARS-benzeri beta-koronavirüs grubundan insanlarda enfeksiyonlara neden olan tek virüsün SARS-CoV-2 olduğudur. PCR yöntemlerinin dayandığı sekanslar, Çin'deki bir laboratuar tarafından sağlanan siliko sekanslardır [23], çünkü PCR testinin geliştirilmesi sırasında bulaşıcı ("canlı") veya inaktif SARS-CoV- kontrol materyali yoktur. Yazarlar için 2 mevcuttu. PCR testi bu nedenle Sarbeco bileşeni için bir kontrol materyali olarak bilinen SARS-CoV sekansı kullanılarak tasarlandı (Dr. Meijer, Corman-Drosten makalesinin ortak yazarı Dr. Peter Borger ile bir e-posta alışverişinde) [2].
Corman-Drosten belgesinde açıklandığı gibi RT-PCR testi ile pozitif çıkan tüm bireylerin SARS-CoV-2 enfeksiyonları için pozitif olduğu varsayılır. Varsayımlarında üç ciddi kusur vardır. İlk olarak, Corman-Drosten belgesinde açıklanan RNA molekülleri için pozitif bir test, "virüs enfeksiyonu" ile eşitlenemez. Pozitif bir RT-PCR testi yalnızca viral RNA moleküllerinin varlığını gösterir. 1d maddesinde (yukarıda) gösterildiği gibi , Corman-Drosten testi tam uzunluktaki virüsü tespit etmek için değil, sadece virüsün bir parçasını tespit etmek için tasarlandı. Bunun testi
SARS virüsü enfeksiyonları için bir teşhis testi olarak uygun olmadığı sonucuna vardık .
İkinci olarak ve büyük önem taşıyan, yayınlanan RT-PCR Testinin işlevselliği, temel bir bilimsel altın standart olan pozitif bir kontrol (izole SARS-CoV-2 RNA) kullanımıyla gösterilmemiştir.
Üçüncüsü, Corman-Drosten gazetesi şunu belirtir:
“Tahlillerin yarasa ile ilişkili SARS ile ilişkili diğer virüsleri tespit edebildiğini göstermek için, E gen tahlilini Drexler ve diğerlerinden temin edilebilen altı yarasadan türetilmiş dışkı örneğini test etmek için kullandık. […] Ve Muth ve diğerleri. […]. Bu virüs pozitif örnekler, Avrupa rinolofid yarasalarından kaynaklandı. SARS ile ilgili CoV sınıfında bu filogenetik aykırı değerlerin tespiti, tüm Asya virüslerinin muhtemelen tespit edilebileceğini göstermektedir. Bu, teorik olarak, bir hayvan rezervuarından değişken virüslerin birden fazla bağımsız edinimi durumunda bile geniş bir hassasiyet sağlayacaktır. "
Bu ifade, Corman-Drosten makalesinde açıklandığı gibi RT-PCR testinde kullanılan E geninin SARS-CoV-2'ye özgü olmadığını göstermektedir.
E geni primerleri ayrıca geniş bir yelpazede diğer SARS virüslerini de tespit eder.
Koronavirüsün genomu, insanları enfekte eden tüm RNA virüslerinin en büyüğüdür ve hepsi çok benzer moleküler yapıya sahiptir. Yine de SARS-CoV1 ve SARS-CoV-2, onları diğer koronavirüslerden ayıran oldukça spesifik iki genetik parmak izine sahiptir. İlk olarak, SARS-CoV ve SARS-CoV-2'nin N-proteininde benzersiz bir parmak izi dizisi (KTFPPTEPKKDKKKK) mevcuttur [13,14,15]. İkinci olarak, hem SARS-CoV1 hem de SARS-CoV2 HE proteinini içermezken, diğer tüm koronavirüsler bu gene sahiptir [13, 14].Bu nedenle, bir SARS-CoV1 ve SARS-CoV-2 PCR ürününü spesifik olarak tespit etmek için, N genindeki yukarıdaki bölgenin amplifikasyon hedefi olarak seçilmesi gerekir. Güvenilir bir teşhis testi, doğrulama testi olarak N genindeki bu spesifik bölgeye odaklanmalıdır. Bu N geni için PCR , SARS-CoV orijinal probu [1] ile "çok hassas olmadığı" için Drosten-Corman makalesi tarafından bir test geni olarak daha fazla onaylanmadı veya önerilmedi .
Ayrıca, hem SARS-CoV1 hem de SARS-CoV-2'de HE geninin yokluğu, bu geni diğer koronavirüsleri dışlamak için ideal negatif kontrol haline getirir. Corman-Drosten kağıdı bu negatif kontrolü veya başka negatif kontrolleri içermez.Corman-Drosten makalesinde yer alan PCR testi, bu nedenle, diğer koronavirüslerin varlığını dışlamak için ne benzersiz bir pozitif kontrol ne de negatif bir kontrol içerir. Bu, testi teşhis için uygun olmayan olarak sınıflandıran bir başka büyük tasarım hatasıdır.
6. Standart Operasyonel Prosedür (SOP) mevcut değildir
Tüm laboratuarların aynı test koşullarını ayarlayabilmesi için yukarıdaki parametreleri kesin olarak belirten bir Standart Çalışma Prosedürü (SOP) mevcut olmalıdır. Doğrulanmış bir evrensel SÇP'ye sahip olmak esastır, çünkü ülkeler içinde ve arasında veri karşılaştırmasını kolaylaştırır. Tüm primer parametrelerini kesin olarak belirtmek çok önemlidir. Bunun yapılmadığını not ediyoruz.Ayrıca, bir numunenin ne zaman pozitif veya negatif olarak kabul edilmesi gerektiğini gösteren Ct değeri belirtilmemiştir. Bir örneğin SARS-CoV virüsleriyle enfekte olduğu düşünüldüğünde de belirtilmemiştir. Yukarıda gösterildiği gibi, test virüs ve virüs parçaları arasında ayrım yapamaz, bu nedenle pozitifliği gösteren Ct değeri çok önemlidir. Bu Ct değeri, Standart Operasyonel Prosedürde (SOP) belirtilmeli ve çevrimiçi hale getirilmelidir, böylece bu testi gerçekleştiren tüm laboratuvarlar tam olarak aynı sınır koşullarına sahip olmalıdır. Böyle bir SÇP'nin bulunmadığına dair kusurlu bilime işaret eder. Laboratuvarlar bu nedenle testi uygun gördükleri şekilde yürütmekte özgürdür ve bu da muazzam miktarda varyasyona neden olur. Avrupa'nın her yerindeki laboratuarlar çok sayıda soruyla baş başa kalıyor; hangi astarlar sipariş edilecek? Tanımlanmamış yerlere hangi nükleotidler doldurulacak? hangi Tm değerini seçmelisiniz? Kaç PCR döngüsü çalıştırılacak? Numune hangi Ct değerinde pozitiftir? Ve ne zaman olumsuz? Ve kaç tane gen test edilecek? Corman-Drosten makalesinde Tablo 2'de gösterildiği gibi tüm genler mi yoksa sadece E ve RpRd geni mi test edilmelidir? N geni de test edilmeli mi? Ve negatif kontrolleri nedir? Olumlu kontrolleri nedir?
Açıklandığı gibi protokol, maalesef tasarımında çok belirsiz ve yanlıştır, onlarca farklı yöne gidebilir. Herhangi bir standardizasyon veya bir SOP yok gibi görünmektedir, bu nedenle bu testin nasıl uygulanacağı açık değildir.
7. 1-5'te açıklanan hataların sonuçları: yanlış pozitif sonuçlar.
Corman-Drosten makalesinde açıklanan RT-PCR testi o kadar çok moleküler biyolojik tasarım hatası içerir ki (bkz. 1-5) kesin sonuçlar elde etmek mümkün değildir. Bu testin muazzam sayıda sözde “yanlış pozitif” üretmesi kaçınılmazdır. Yanlış pozitiflerin tanımı, başlangıçta pozitif olan ancak aynı testle tekrar test edildikten sonra negatif olan negatif bir örnektir. Yanlış pozitifler, hatalı pozitif test sonuçlarıdır, yani pozitif test eden negatif örnekler. Ve bu gerçekten de Corman-Drosten gazetesinde bulunan şeydir. Makalenin PDF'sinin 6. sayfasında yazarlar, iyi kontrol edilen laboratuvar koşullarında bile, bu testle hatırı sayılır oranda yanlış pozitif üretildiğini göstermektedir:
Dört ayrı test reaksiyonunda, zayıf başlangıç reaktivitesi görüldü, ancak aynı test ile tekrar test edildiğinde negatifti. Bu sinyaller herhangi bir belirli virüsle ilişkilendirilmedi ve ilk pozitif reaktivitenin meydana geldiği her virüs için, aynı virüsü daha yüksek bir konsantrasyonda içeren ancak pozitif test etmeyen başka örnekler vardı. Yukarıda açıklanan kapsamlı teknik yeterliliğin sonuçları göz önüne alındığında, bu ilk reaktivitenin gerçek zamanlı PCR problarının kimyasal istikrarsızlığından ve büyük olasılıkla bu değerlendirme sırasında yeni tanı testleri ve kontrollerinin hızlı bir şekilde uygulanmasının neden olduğu sorunları ele almaktan kaynaklanmadığı sonucuna varıldı. ders çalışma." [1]
Bu alıntıdaki ilk cümle, Corman-Drosten makalesinde açıklanan PCR testinin yanlış pozitifler oluşturduğunun açık bir kanıtıdır. Son teknoloji ürünü Charité laboratuvarının iyi kontrol edilen koşulları altında bile, tanım başına 310 birincil testten 4'ü yanlış pozitiftir. Dört negatif numune başlangıçta pozitif test edildi, ardından tekrar test edildiğinde negatif çıktı. Bu, yanlış pozitifin klasik örneğidir. Bu durumda yazarlar onları yanlış pozitifler olarak tanımlamazlar ki bu entelektüel olarak sahtekârdır.
Yukarıdaki alıntıdaki bir başka açıklayıcı gözlem, yazarların yanlış pozitifleri “yeni teşhis testlerinin hızlı bir şekilde uygulanmasının neden olduğu sorunları ele almak” olarak açıklamalarıdır. Normalde bir SÇP'de açıklanan gerekli tüm bilgiler olmadan testi uygulamaya koymak zorunda olan laboratuvarları hayal edin.
8. Corman-Drosten makalesi hakem incelemesinden geçmedi
Bilimsel bir dergide resmi olarak yayınlanmadan önce, bilimsel ve tıbbi makaleler geleneksel olarak "meslektaş değerlendirmesi" tarafından onaylanır. Bu süreçte derginin editörleri, makaleyi değerlendiren ve varsayımlarında, yöntemlerinde ve sonuçlarında zayıflıkları tespit edebilen çeşitli uzmanlardan (“hakemler”) tavsiyeler alır. Tipik olarak bir dergi, editörler yazarların hakemlerin endişelerini ele aldığından ve sunulan verilerin makaledeki sonuçları desteklediğinden emin olduktan sonra bir makale yayınlar. " Bu süreç, Eurosurveillance [16] için de iyi tanımlanmıştır.
Corman-Drosten raporu, 21 Ocak 2020'de Eurosurveillance'a gönderildi ve 22 Ocak 2020'de yayımlanmak üzere kabul edildi. 23 Ocak 2020'de makale çevrimiçiydi. 13 Ocak 2020'de protokolün 1-0 sürümü resmi DSÖ web sitesinde [17] yayınlandı, 17 Ocak 2020'de belge sürümü 2-1 [18] olarak güncellendi, hatta Corman-Drosten makalesi 23 Ocak'ta yayınlanmadan önce. Avro gözetim.
Normalde, meslektaş değerlendirmesi zaman alan bir süreçtir çünkü alandan en az iki uzmanın gönderilen makaleyi eleştirel bir şekilde okuyup yorum yapması gerekir. Bize göre, bu makale hakem incelemesinden geçmedi. Tam bir akran değerlendirmesi yapmak için yirmi dört saat yeterli değildir. Vardığımız sonuç, PCR testini SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için bir teşhis aracı olarak tamamen uygunsuz kılan çok sayıda çok ciddi tasarım kusurunun tarafımızdan bulunması gerçeğiyle desteklenmektedir. RT-PCR tasarımına aşina olan herhangi bir moleküler biyolog, gerçek inceleme sürecinden önce Corman-Drosten makalesinde bulunan ciddi hataları kolayca gözlemleyebilirdi. 26 Ekim 2020'de Eurosurveillance'dan bize emsal değerlendirme raporunun bir kopyasını göndermesini istedik. Bugüne kadar bu raporu almadık ve 18 Kasım 2020 tarihli bir mektupta, Eurosurveillance için ev sahibi olarak ECDC, kararları için önemli bilimsel nedenler sunmadan erişim sağlamayı reddetti. Aksine, "ifşa etmenin bilimsel araştırmaların amacına zarar vereceğini" yazıyorlar. [24].
9. Editör olarak yazarlar
Son bir nokta, büyük endişelerden biridir. Corman-Drosten makalesinin iki yazarı Christian Drosten ve Chantal Reusken'in de bu derginin yayın kurulunun üyeleri olduğu ortaya çıktı [19]. Bu nedenle, makalenin hakemli olmadığına dair şüpheleri güçlendiren ciddi bir çıkar çatışması vardır. Görünüşe göre hızlı yayın, sadece yazarlar da Eurosurveillance'daki yayın kurulunun bir parçası oldukları için mümkündü. Bu uygulama, bilimsel bütünlükten ödün veren olarak sınıflandırılır.
BİLDİRİNDE BULUNAN HATALARIN ÖZET KATALOĞU
Corman-Drosten kağıdı aşağıdaki belirli hataları içerir:
1. Bu protokolde bu son derece yüksek primer konsantrasyonlarını kullanmak için belirli bir neden yoktur. Tanımlanan konsantrasyonlar, spesifik olmayan bağlanmalara ve PCR ürün amplifikasyonlarına yol açarak, testi SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için spesifik bir tanı aracı olarak uygunsuz hale getirir.
2. Belirtilmemiş altı titrek pozisyon, bu testin gerçek dünya laboratuvar uygulamalarında muazzam bir değişkenlik getirecektir; Corman-Drosten belgesindeki kafa karıştırıcı spesifik olmayan açıklama, Standart Çalışma Protokolü olarak uygun değildir ve bu, testi SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için belirli bir tanı aracı olarak uygunsuz kılar.
3. Test, tüm virüs ve viral fragmanlar arasında ayrım yapamaz. Bu nedenle, test, bozulmamış (bulaşıcı) virüsler için bir teşhis olarak kullanılamaz ve bu, testi SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak ve bir enfeksiyonun varlığı hakkında çıkarımlar yapmak için özel bir teşhis aracı olarak uygunsuz hale getirir.
4. Primer çifti1 (RdRp_SARSr_F ve RdRp_SARSr_R) için tavlama sıcaklığı Tm'ye göre 10 ° C'lik bir fark, testi SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için özel bir teşhis aracı olarak uygunsuz hale getirir.
5. Ciddi bir hata, örneğin pozitif ve negatif olarak kabul edildiği bir Ct değerinin ihmal edilmesidir. Bu Ct değeri ayrıca, testi SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için özel bir tanı aracı olarak uygun olmayan takip sunumlarında bulunmaz.
6. PCR ürünleri moleküler düzeyde valide edilmemiştir. Bu gerçek, protokolü SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için özel bir teşhis aracı olarak işe yaramaz hale getirir.
7. PCR testi, SARS-CoV-2 için özgüllüğünü değerlendirmek için benzersiz bir pozitif kontrol veya diğer koronavirüslerin varlığını dışlamak için bir negatif kontrol içermediğinden, testi SARS-CoV-2'yi tanımlamak için spesifik bir tanı aracı olarak uygunsuz kılar. virüs.
8. Corman-Drosten kağıdındaki test tasarımı o kadar belirsiz ve kusurlu ki düzinelerce farklı yöne gidebilirsiniz; hiçbir şey standartlaştırılmamıştır ve SOP yoktur. Bu, testin bilimsel geçerliliğini oldukça sorgular ve SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için özel bir teşhis aracı olarak uygun değildir.
9. Büyük olasılıkla, Corman-Drosten kağıdı, SARS-CoV-2 virüsünü tanımlamak için testin özel bir teşhis aracı olarak uygun olmamasına neden olacak şekilde hakem tarafından incelenmemiştir.
10. Corman-Drosten makalesinin iki yazarının (Christian Drosten ve Chantal Reusken) Eurosurveillance yayın kurulu üyesi olmasına ek olarak, en az dört yazar için ciddi çıkar çatışmaları buluyoruz. 29 Temmuz 2020'de bir çıkar çatışması eklendi (Olfert Landt, TIB-Molbiol'ün CEO'su; Marco Kaiser, GenExpress'te kıdemli araştırmacı ve TIB-Molbiol için bilimsel danışman olarak görev yapıyor), orijinal versiyonda açıklanmayan (ve hala PubMed sürümünde eksik); TIB-Molbiol, Corman-Drosten el yazmasında yayınlanan protokole dayalı olarak PCR kitleri (Light Mix) üreten “ilk” şirkettir ve bu PCR-test kitlerini kendi sözlerine göre yayına başlamadan önce dağıtmışlardır. hatta gönderildi [20]; ayrıca, Victor Corman & Christian Drosten ikinci bağlantılarından bahsetmedi: ticari test laboratuvarı "Labor Berlin". Her ikisi de oradaki virüs teşhislerinden sorumludur [21] ve şirket gerçek zamanlı PCR testi alanında faaliyet göstermektedir.
Corman-Drosten belgesinde açıklanan SARS-CoV-2'yi tanımlamak için test protokolünü yeniden incelememiz ışığında, SARS-CoV-2 PCR testini işe yaramaz hale getiren hatalar ve doğal yanlışlıklar ile ilgili belirledik.
SONUÇ
Hangi test protokollerinin yayınlandığına ve yaygın olarak kullanıma sunulacağına ilişkin karar, doğrudan Eurosurveillance'ın elindedir. Corman-Drosten makalesinde görünen hataları tanıma kararı, ileriye dönük insan maliyetini ve ıstırabı büyük ölçüde en aza indirme yararına sahiptir.
Bu belgeyi geri çekmek Avrupa gözetiminin yararına değil mi? Bizim sonucumuz açık. Burada açıklanan muazzam PCR protokolü tasarım kusurları ve hataları karşısında şu sonuca varıyoruz: Bilimsel bütünlük ve sorumluluk çerçevesinde pek fazla seçenek kalmadı.
REFERANSLAR
[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Gerçek zamanlı RT-PCR ile 2019 yeni koronavirüsün (2019-nCoV) tespiti. Euro Gözetimi. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
[2] Dr. Peter Borger ve Dr. Adam Meijer arasındaki e-posta iletişimi: Tamamlayıcı Materyal
[3] Jafaar ve diğerleri, 1941 Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 İzolatı Dahil 3790 Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu - Pozitif Numuneler ve Pozitif Hücre Kültürleri Arasındaki Korelasyon. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603
[4] BBC, 21 Ocak 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836 ;
Arşiv: https://archive.is/0qRmZ
[5] Google Analytics - dünya çapında COVID19-ölümleri: https://bit.ly/3fndemJ
Arşiv: https://archive.is/PpqEE
[6] COVID-19 Acil Durum Müdahale Teknik Merkezi, NIVD için
Çin CDC'si altında laboratuvar testi 15 Mart 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf
[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf
Nolan T, Huggett J, Sanchez E. Kantitatif PCR (qPCR) First Edition 2013 uygulaması için iyi uygulama kılavuzu
[8] Trestan Pillonel ve diğerleri, Editöre mektup: Gerçek zamanlı RT-PCR ile SARS-CoV-2 algılama: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/
[9] Kurkela, Satu ve David WG Brown. "Moleküler tanı teknikleri." Tıp 38.10
(2009): 535-540.
[10] Wolfel ve ark., COVID-2019 ile hastanede yatan hastaların virolojik değerlendirmesi
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x
[11] Thermofischer Primer Dimer Web Aracı: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library /thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html
Ek Materyal
[12] Primer-BLAST, NCBI - Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW ve diğerleri. (2003) Science.
SARS ile ilişkili koronavirüsün genom sekansı. Science 300 (5624): 1399-1404.
[14] Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2, Wuhan-Hu-1'i izole eder, tam
genom: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947
[15] Borger P. SARS benzeri bir Koronavirüs bekleniyordu ancak hazırlık için hiçbir şey yapılmadı. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared ;
Arşiv: https://archive.is/i76Hu
[16] Eurosurveillance kağıt değerlendirme / inceleme süreci: https://www.eurosurveillance.org/evaluation
[17] Corman-Drosten protokolünün ve el yazmasının DSÖ tarafından 13 Ocak 2020'de belgenin 1.0 sürümü olarak yayınlanan resmi önerisi:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -test-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf ; arşiv: https://bit.ly/3m3jXVH
[18] Corman / Drosten RT-qPCR protokolü için resmi WHO tavsiyesi,
doğrudan Eurosurveillance-yayından, belge-sürüm 2-1,
17 Ocak 2020'de yayınlanmıştır : https://www.who.int/ docs / default-source / coronaviruse / protocol-
v2- 1.pdf? sfvrsn = a9ef618c_2
[19] Eurosurveillance Yayın Kurulu, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets / imgs / 2020-09-Editorial% 20Board% 20PDF.pdf ;
Arşiv: https://bit.ly/2TqXBjX
[20] Kullanım Talimatları LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, 11 Ocak 2020: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1 ) .pdf
Arşiv, zaman damgası - 11 Ocak 2020: https://archive.is/Vulo5 ;
Arşiv: https://bit.ly/3fm9bXH
[21] Labor Berlin'de viral teşhisten sorumlu Christian Drosten & Victor Corman:
https://www.laborberlin.com/fachbereich/virologie/
Arşiv: https://archive.is/CDEUG
[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan COVID-
19 bulaşıcılık değerlendirmesi için Viral kültürler . Sistematik inceleme. Sistematik inceleme doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4
[23] Kim ve diğerleri, SARS-CoV-2 Transcriptome Mimarisi:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062
[24] ECDC Dr. Peter Borger'a yanıtı, 18 Kasım 2020:
Ek Materyal
[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & ekip, anket ve Primer-BLAST tablosu:
Tamamlayıcı Materyal
Ek literatür:
Açıklama RT-PCR RKI Almanya, bu bağlantının 10. sayfada:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichtdienstleistungen/GBE
? DownloadsJ / JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf __ damla = p
ublicationFile
Leave a Comment